|
|
Charakterizace vazby transkripčních faktorů CSL na DNA v kvasince Schizosaccharomyces pombe
Jordáková, Anna ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Čáp, Michal (oponent)
Proteiny Cbf11 a Cbf12, patřící do rodiny transkripčních faktorů CSL, jsou u poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe zapojeny v široké škále buněčných procesů - mj. regulují buněčnou adhezi a podílejí se na udržování integrity genomu. V rámci celého genomu jsme již dříve identifikovali cílové lokusy, kam se proteiny CSL váží in vivo. Mnoho z cílových míst neobsahuje konsenzuální CSL-vazebný element. Patrně existují různé režimy vazby proteinů Cbf11/12 na DNA a doposud nebylo známo, s jakou biologickou funkcí je způsob vazby na DNA spojen. Pro účely studia DNA-vazebných módů proteinů CSL jsme v rámci tohoto projektu pracovali na zavedení DNA-vazebné mutace (DBM), která způsobuje ztrátu schopnosti proteinů CSL se vázat na kanonický motiv in vitro, do chromozomálního lokusu genů cbf11 a cbf12. S použitím "ura4 selekčního systému" jsme úspěšně zkonstruovali kmeny Cbf12-TAP a Cbf12DBM-TAP, tj. kmeny bez/s DBM v otevřeném čtecím rámci Cbf12, ve kterých je navíc protein Cbf12 C-terminálně značen TAP-tagem a obsahuje intaktní oblast 3'UTR. Nově jsme v naší laboratoři zavedli CRISPR/Cas9 systém, s využitím kterého se nám podařilo připravit kmen Cbf11-TAP. S konstrukcí kmene Cbf11DBM-TAP jsme prozatím neuspěli, nicméně v rámci práce diskutujeme možné optimalizace konstrukčního postupu, které by mohly vést...
|
|
|
The role of CSL proteins in oxidative stress response of Schizosaccharomyces pombe
Tvarůžková, Jarmila ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Rallis, Charalampos (oponent)
Oxidativní stres představuje komplexní a intenzivně studovaný fenomén, který je úzce spjat s řadou lidských onemocnění a procesem stárnutí u široké škály organizmů. V nedávné době bylo popsáno velké množství klíčových buněčných regulátorů včetně signální dráhy Notch jako proteinů reagujících na redoxní stav buňky. V této práci jsme popsali roli proteinů CSL (CBF1/Su(H)/LAG-1), efektorů signální dráhy Notch u živočichů, v odpovědi na oxidativní stres u kvasinky Schizosaccharomyces pombe. S. pombe obsahuje dva paralogy proteinů CSL, Cbf11 a Cbf12, které fungují antagonisticky při regulaci buněčného cyklu a adheze. Oba proteiny jsou schopny vázat kanonický CSL element a aktivovat transkripci, takže fungují jako pravé transkripční faktory CSL. Zjistili jsme, že kmen postrádající gen cbf11 je rezistentní vůči peroxidu vodíku ale ne vůči menadionu, zdroji superoxid anion radikálu. Analýzou genetických interakcí u dvojitých deletantů jsme odhalili, že rezistence mutanta Δcbf11 je závislá na přítomnosti antioxidačních enzymů katalázy a sulfiredoxinu. Geny kódující tyto enzymy jsou pod transkripční kontrolou signální dráhy MAP kinázy Sty1 a transkripčního faktoru Pap1, které jsou také nezbytné pro rezistenci buněk Δcbf11. Cbf12 pravdepodobně hraje pouze minoritní roli v odpovědi na oxidativní stres, nicméně...
|
|
|
The molecular mechanism of CSL protein participation in oxidative stress response in Schizosaccharomyces pombe
Daněk, Petr ; Převorovský, Martin (vedoucí práce) ; Sipiczki, Matthias (oponent)
Pro správné fungování organismu je nezbytné udržovat v jeho buňkách vyvážený redoxní stav, neboť zatímco relativně nízká koncentrace volných kyslíkových radikálů je třeba pro adekvátní transdukci signálů, vyšší koncentrace těchto molekul (oxidativní stres) má prokazatelně škodlivé účinky a je spojena s řadou patologických stavů a onemocnění. Z tohoto důvodu se v buňkách během evoluce vyvinula široká škála vysoce konzervovaných antioxidačních mechanismů. Byly zevrubně popsány rozsáhlé a složité interakční vztahy mezi signálními proteiny a drahami regulujícími odpověď na oxidativní stres, nicméně naše znalost odpovědi na oxidativní stres ještě není kompletní a stále jsou objevovány nové regulační proteiny a mechanismy. Výsledky několika současných vědeckých prací ukazují, že se transkripční faktory patřící do proteinové rodiny CSL, které jsou nezbytné zejména pro embryonální vývoj metazoí jako efektory signální dráhy Notch, mohou na regulaci odpovědi na oxidativní stres také podílet. Poltivá kvasinka Schizosaccharomyces pombe, hojně používaný a pro studium buněčných odpovědí na stresové podněty dobře etablovaný modelový organismus, obsahuje dva paralogy transkripčních faktorů CSL, nazvané Cbf11 a Cbf12. Naše laboratoř ukázala, že buňky s delecí genu cbf11 jsou vysoce rezistentní vůči peroxidu vodíku....
|
host ::
RSS.